Nació el 27 de diciembre de 1822 en Dôle, Francia, donde transcurrió su infancia. De joven, no fue un estudiante prometedor en ciencias naturales; de hecho, si demostraba alguna actitud especial, era en el área artística de la pintura. Su primera ambición fue la de ser profesor de arte. En 1842, tras ser maestro en la Escuela Real de Besanzón, obtuvo su título de bachillerato, con calificación "mediocre" en química. Su padre lo mandó a la Escuela Normal Superior de París, pero allí no duró mucho tiempo ya que regresó a su tierra natal. Al año siguiente retornó a París cargado de nuevas ilusiones y con la determinación de mejorar en Física y Química. Entre los años 1847 y 1853 fue profesor de Química en Dijon y luego en Estrasburgo, donde conoció a Marie Laurent, la hija del rector de la Universidad, con quien contrajo matrimonio en 1849. El matrimonio tuvo cinco hijos, pero solo sobrevivieron hasta la vida adulta dos de ellos: Jean-Baptiste y Marie-Luise. Los otros tres fallecieron tempranamente, afectados por el tifus.
Se cuenta una ilustrativa anécdota a propósito de este Pasteur de los últimos años:
En un viaje en tren se hallaba rezando un rosario. En el departamento entró un joven universitario librepensador que al ver al anciano entregado a sus piadosas oraciones le dijo “¿por qué en vez de rezar, no aprovecha el tiempo para aprender y formarse un poco más? Yo puedo enviarle algún libro para que se instruya". Louis le sonrió y le dio su tarjeta diciendo “le estaría muy agradecido si me enviara el libro a esta dirección". Al ver que había estado reconviniendo por su ignorancia al sabio más ilustre de Francia, el joven enrojeció hasta las orejas. Pero Pasteur no le hizo ningún reproche: era un buen consejo el de instruirse y el anciano siempre estaba dispuesto a escuchar a quién pudiera enseñarle algo más.Y siguió rezando el rosario.
